Anales de la RANM

68 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 ESFINGOLÍPIDOS SENCILLOS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA Félix M. Goñi Urcelay Año 2018 · número 135 (01) · páginas 65 a 71 aspectos interesantes de la formación de dominios en films monomoleculares de fosfolípidos. Estudios de epifluorescencia de monocapas de esfingomieli- na permitieron seguir en tiempo real la formación de dominios mediante la acción de una esfingomie- linasa añadida a la subfase acuosa. Con ello demos- traron que la formación de Cer inicialmente altera la topografía de superficie induciendo separación de fase de dominios en fases líquido-condensadas (en- riquecidas en Cer) y líquido-expandidas (enriqueci- das en esfingomielina) (33). La fase enriquecida en Cer crece a ritmo constante según avanza la reacción de hidrólisis hasta el ‘punto de percolación’, cuando los dominios condensados se juntan en uno conti- nuo que contiene la fase expandida. En este punto, la velocidad de reacción se detiene rápidamente, indi- cando que la organización supramolecular en domi- nios tiene gran influencia en la actividad enzimáti- ca a nivel molecular local. También es significativa la observación (33) de que la topografía de super- ficie derivada de una reacción de esfingomielinasa es diferente a la obtenida mediante la mezcla previa de esfingomielina y ceramida en la misma propor- ción, lo que indica que los resultados también de- penden del modo de generar la superficie. Los do- minios de Cer en vesículas, en lugar de en monoca- pas, fueron descritos por Sot y cols. (31), utilizan- do calorimetría diferencial de barrido (DSC) y mi- croscopía de fluorescencia. Los resultados de DSC indicaron para esfingomielina de huevo una tran- sición estrecha centrada en 39 ºC. La ceramida de huevo, incluso a proporciones bajas (5% mol) tuvo el efecto de ensanchar la transición y desplazarla hacia temperaturas más altas. Más importante, las endotermas de las muestras con Cer tenían un per- fil claramente asimétrico, indicando la formación de dominios esfingomielina/ceramida de alto pun- to de fusión. Además, se observaron GUVs utilizando micros- copía de fluorescencia y la sonda fluorescente 1,1’-dioctadecil-3,3,3’3’-tetrametilindocarbociani- na perclorato (DiIC 18 ) que se ubica preferentemente en las fases más fluidas de un entorno de membra- na heterogéneo. Las vesículas de esfingomielina, sin Cer, mostraban una fluorescencia uniforme, mien- tras que aquéllas que contenían Cer mostraban áreas oscuras, que correspondían a dominios rígidos enri- quecidos en Cer. El aumento paulatino de la concen- tración de Cer causó un aumento equiparable de las áreas oscuras, que perdieron su forma circular. El fe- nómeno de la separación de fase de Cer a dominios laterales en un entorno de fosfolípidos ha sido revi- sado en detalle (61). La presencia y estabilidad de estos dominios enri- quecidos en Cer afecta al orden de los otros lípidos presentes en la membrana, dado que los dominios están enriquecidos en Cer pero también incluyen proporciones variables de los demás lípidos presen- tes en el sistema. Este efecto causa permeabilización de la membrana y liberación del contenido vesicu- lar (37, 62). Los mecanismos de este efecto no son conocidos del todo, y mientras que se ha sugerido la existencia de canales/poros de Cer a través de los dominios (62), la formación espontánea de poros en el dominio enriquecido en Cer debería superar una gran barrera de energía entrópica para que las molé- culas se reorganizasen en un poro toroidal. Por tan- to se ha propuesto una hipótesis alternativa según la cual el flujo de solutos ocurriría debido a defec- tos estructurales (29, 32), causados por los dominios enriquecidos en Cer en la interfase entre el dominio y la fase continua. El distinto grado de empaqueta- miento molecular de ambas fases y la diferencia de grosor (63) causarían un emparejamiento ineficiente en la frontera de la interfase (10). La tendencia de las Cer a formar fases no-lamelares podría ser un factor adicional en la desestabilización de la bicapa, facili- tando así la liberación de contenido vesicular (32). Montes y cols. (37) encontraron que la formación de ceramida en vesículas unilamelares grandes (LUVs), que contenían dextranos funcionalizados con fluo- resceína, causaba la liberación de dextranos de masa molecular ∼ 20 kDa, mayor que la del citocromo c (cuya salida desde la mitocondria es un paso rele- vante para la cascada de señalización de muerte ce- lular). Los autores compararon la liberación de con- tenidos de la ceramida generada mediante esfingo- mielinasa con la liberación causada por ceramida externamente añadida, y comprobaron que la gene- ración mediante esfingomielinasa producía una li- beración más rápida y efectiva (37). Además del flujo de solutos anteriormente citado, las Cer de cadena larga también presentan otros tres efectos importantes: (i) aumentan la tendencia de las bicapas a adoptar una curvatura negativa (como la de una fase hexagonal invertida) (32, 64), (ii) promueven el movimiento de lípidos de un lado a otro de la bicapa (flip-flop) (40) y (iii) aumentan los espacios de volumen libre en las bicapas (espa- cios vacantes no ocupados por ninguna molécula) (43, 44). Estas propiedades biofísicas cracterísticas podrían estar relacionadas con el modo con el que Cer induce la muerte celular (65) y podrían ser de ayuda para adquirir una correcto comprensión del proceso. El caso del flip-flop lipídico es de especial interés ya que la pérdida de la asimetría de bica- pa es una de las características de los procesos de muerte celular. Por otra parte, Cer de cadena corta se mezclan mucho mejor con los fosfolípidos, pro- mueven una curvatura positiva y su efecto sobre la permeabilidad de bicapa o el flip-flop son muy bajos o inexistentes (30). Notas finales: Papel biológico de los esfingo- lípidos y biofísica de membranas Uno de los aspectos más complejos de la investiga- ción en esfingolípidos es el establecer una correla- ción directa y precisa entre sus efectos biológicos (señalización celular) y sus efectos biofísicos en las membranas celulares. Este es un gran problema en este momento ya que no sólo habría que contar con las interacciones lípido-lípido sino también con las interacciones lípido-proteína. Afortunadamente, es- tas últimas están adquiriendo cada vez más atención y siendo objeto de más estudios, y algunas proteínas parecen ser capaces de seleccionar esfingolípidos muy específicos, ignorando otros parecidos (66). Esto abre una prometedora y novedosa área de in- vestigación.