Anales de la RANM

20 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 S U P L E M E N T O I SIMPOSIO · JÓVENES INVESTIGADORES Libro de Abstracts An RANM. 2021;138(03).supl01: 20 - 54 El sistema oxitocinérgico regula funciones homeos- táticas vitales y distintos aspectos de la interac- ción social como la memoria social. La desregula- ción de este sistema se ha implicado en desórdenes neurológicos caracterizados por déficits sociales como el trastorno del espectro autista. A pesar de su importante acción neuromoduladora, aún se desconocen muchos detalles sobre las propie- dades y el mecanismo de liberación de la oxitocina (OXT) en el Sistema Nervioso Central (SNC). Las neuronas oxitocinérgicas del hipotálamo son las responsables de modular los niveles de OXT en el cerebro principalmente a través de eventos de libera- ción somatodendrítica. Sin embargo, la maquinaria de fusión responsable de la secreción de OXT no ha sido caracterizada en detalle, principalmente por la carencia de marcadores específicos. El análisis de la expresión de proteínas SNARE y sinaptotag- minas, reveló que dos proteínas SNARE: SNAP-47 y SNAP-23 se localizan en el compartimento somatodendrítico de las neuronas oxitocinérgicas, sugiriendo un papel en la exocitosis de OXT ( Figura 1A ). Nuestros datos indican que la expresión de estas isoformas se encuentra regulada durante el desarrollo. Así, mientras que SNAP-47 está presente en el hipotálamo desde el estadío prenatal, la expresión de SNAP-23 no es detectable hasta la edad adulta. Técnicas de chasing vesicular en célula única han demuestrado un aumento significativo de la probabilidad de liberación de OXT en respuesta a la estimulación neuronal durante los primeros segundos (60 s), mientras que tiempos de estimu- lación prolongados (p.ej. 10 min) no afectan a la probabilidad de liberación sugiriendo una depleción de vesículas de OXT listas para ser liberadas ( Figura 1B ). Nuestros resultados indican que la exocitosis de OXT preferentemente ocurre en regiones enriquecidas con SNAP-47 ( Figura 1C ), a través un mecanismo parcialmente indepen- diente de la entrada de calcio. Paralelamente se ha realizado un análisis exhaustivo de la dinámica y propiedades de liberación de OXT en neuronas hipotalámicas en cultivo combinando novedosas técnicas de imagen con la línea del ratón transgé- nico OXT-tdTomato ( Figura 1D ), que permite la identificación de las vesículas de OXT. La visuali- zación de vesículas somatodendríticas de OXT ha revelado la existencia de poblaciones vesicu- lares con diferentes dinámicas en respuesta a la estimulación neuronal. Se identificaron cuatro grupos principales: i ) vesículas dinámicas, las cuales se movilizan durante los primeros 10 s de estimulación, ii ) vesículas tardías, el grupo más abundante, con cambios de desplazamiento tras 20-40 s de estimulación ( Figura 1E ); iii ) vesículas desacopladas, las cuales experimentan cambios de movilidad durante el periodo final de estimu- lación; y iv ) vesículas estables (sin movilidad detectable). Registros electrofisiológicos prelimi- nares indican que las neuronas oxitocinérgicas en cultivo presentan cinéticas lentas de despolariza- ción, lo que podría subyacer la dinámica tardía de las vesículas de OXT y su dependencia parcial a la entrada de calcio. Nuestros resultados han revelado la existencia de diferentes grupos de vesículas de OXT, que se movilizan de forma diferente en respuesta al mismo estímulo, una característica hasta ahora desconocida y que puede ser relevante para la modulación fina del comportamiento. The oxytocinergic system regulates vital homeos- tatic functions and different aspects of social interaction such as social bonding or social memory. Dysregulation of this system has been implicated in neurological disorders characterized by social deficits such as autism spectrum disorder. Despite its important neuromodulatory action, many details about the properties and release mechanism of oxytocin (OXT) in the Central Nervous System (CNS) are still unknown. Oxytocinenergic neurons in the hypothalamus are responsible for modulating OXT levels in the brain mainly through somatodendritic release events. However, the fusion machinery responsible for OXT secretion has not been characterized in detail, mainly due to the lack of specific markers for these vesicles in neurons. Analysis of the expression of SNARE and synaptotagmin proteins revealed that two SNARE proteins: SNAP-47 and SNAP-23 are found in the somatodendritic compartment of oxytocinenergic neurons, suggesting a role in OXT exocytosis ( Figure 1A ). Our data indicate that the expression of these isoforms is developmentally regulated. Thus, whereas SNAP-47 is present in the hypothalamus from the prenatal stage, the expres- sion of SNAP-23 is not detectable until adulthood. Single cell vesicular chasing techniques have demonstrated a significant increase in the probabi- lity of OXT release in response to neuronal stimula- tion during the first seconds of stimulation (60 s), whereas longer stimulation times (10 min) do not affect the release probability suggesting a depletion of OXT vesicles ready to be released ( Figure 1B ). Our results indicate that OXT exocytosis occurs preferen- tially in regions enriched with SNAP-47 ( Figure 1C ), through a mechanism partially independent of calcium influx. In parallel, an exhaustive analysis of the dynamic properties of OXT release in cultured hypothalamic neurons has been carried out combining novel imaging techniques and the transgenic mouse line OXT-tdTomato ( Figure 1D ), which allows the unambiguous identification of OXT vesicles. Visuali- zation of somatodendritic OXT vesicles has revealed the existence of distinct vesicular populations with different dynamics in response to neuronal stimula- DINÁMICA Y MECANISMO MOLECULAR DE LA LIBERACIÓN DE OXITOCINA EN NEURONAS HIPOTALÁMICAS DYNAMI CS AND MOLECULAR MECHAN I SM O F OX Y TOC I N R E L E AS E I N HY POTHA L AMI C NEURONS Aznar-Escolano B., Madrigal M.P., Jurado S. Instituto de Neurociencias CSIC-UMH, Alicante