Anales de la RANM

30 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 S U P L E M E N T O I SIMPOSIO · JÓVENES INVESTIGADORES Libro de Abstracts An RANM. 2021;138(03).supl01: 30 - 54 Los síndromes periódicos asociados a criopirina (CAPS) son una serie de condiciones heredita- rias que debutan temprano con auto-inflamación producida por distintas mutaciones de ganancia- de-función (GdF) en el gen NLRP3 , originando una activación del inflamasoma NLRP3 y sobrepro- ducción de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1β e IL-18. La activación del inflamasoma NLRP3 silvestre se induce por señales endógenas de daño tisular o exógenas asociadas a patógenos. Este inflama- soma está formado por la proteína NLRP3, la proteína adaptadora ASC y la enzima efectora pro-casapasa-1. Al formarse el inflamasoma, la pro-casapasa-1 se activa y escinde IL-1β e IL-18 a su forma madura. También procesa la proteína gasdermina D (GSDMD), cuyo extremo amino- terminal forma poros en la membrana plasmática, induciendo la liberación de contenido intrace- lular y originando una muerte celular denomi- nada piroptosis. Sin embargo, el mecanismo de activación y regulación del inflamasoma NLRP3 con mutaciones GdF está poco estudiado. En este trabajo estudiamos cómo la proteína NLRP3 con mutaciones GdF se activa en condiciones libre de patógenos en pacientes con CAPS, cómo el MCC950 (un inhibidor específico de NLRP3) puede inhibir esta activación, qué moléculas además de IL-1β e IL-18 se liberan aguas abajo de la activación del inflamasoma mutante y, cómo se regula post-traduccionalmente el inflamasoma NLRP3 con mutaciones GdF. Este trabajo ha empleado macrófagos inmorta- lizados de ratón deficientes en Nlrp3 con un sistema inducible Tet-ON para expresar varios NLRP3 humano con mutaciones GdF presentes en pacientes con CAPS que se compararon con macrófagos transducidos con un vector vacío o un vector que expresa NLRP3 silvestre. Sangre de pacientes con CAPS se empleó para estudiar la producción de IL-1β y la formación de oligómeros de ASC como indicador de activación de NLRP3. Las células fueron tratadas con LPS, Pam3CSK 4 , IL-6, S100A9, IL-1α, TNF-α, palmitato, ATP o cristales de ácido úrico a diferentes concen- traciones y tiempos en ausencia o presencia de MCC950 o de distintos inhibidores de deubiq- uitinasas. El comité de ética clínica aprobó este estudio. A diferencia de la expresión de NLRP3 silvestre, la expresión de NLRP3 con mutaciones GdF resulta en una activación del inflamasoma y consecuente- mente de caspasa-1 y el posterior procesamiento de GSDMD, seguido de la liberación de ciertas proteínas celulares como IL-18, P2X7 y LDH. Por otra parte, solo se observó liberación de IL-1β tras el tratamiento con LPS, Pam3CSK 4 , IL-6, palmitato y S100A9, ya que activan a NF-κB y la expresión del gen de la Il1b . El inhibidor MCC950 confirmó la implicación de NLRP3 al bloquear la liberación de IL-1β, IL-18, HMBG1, IL-1α, P2X7, cistatina B y anexina-1, pero no de TNF-α. Distintos inhibidores de deubiquitinasa fueron capaces de reducir la activación de NLRP3 con mutaciones GdF al reducir el procesamiento de GSDMD y la liberación de IL-1β. Las mutaciones de GdF en NLRP3 inducen una activación basal del inflamasoma respecto a NLRP3 silvestre, y aunque esta activación está estrecha- mente ligada al nivel de expresión, su activación se puede regular e incrementar en respuesta a diferentes señales endógenas (como son IL-6, palmitato o S100A9) y además post-traduccional- mente por la de-ubiquitinación. Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por proyectos de investigación de FEDER/ Ministerio de Ciencia, Innovación y Univer- sidades-Agencia Estatal de Investigación (SAF2017-88276-R; PID2020-116709RB-I00), Fundación Séneca (20859/PI/18, 21081/PDC/19 y 00003/COVI/20), Instituto de Salud Carlos III (DTS21/00080), Comisión Europea H2020-SC1- 2020-Single-Stage-RTD (965196 - PlasticHeal) y del European Research Council (ERC-2013-CoG 614578 y ERC-2019-PoC 899636). Laura Hurtado-Navarro tiene una beca de la Fundación Séneca (Región de Murcia, Spain) 21214/ FPI/19. Cristina Molina-López tiene una beca de Ministerio de Ciencia, Innovación y Universi- dades-Agencia Estatal de Investigación (PRE2018- 087063). Cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS) are a group of hereditary auto-inflammatory disorders that result from the gain-of-function mutations in the NLRP3 gene, resulting in the autoactivation of the NLRP3 inflammasome and the overproduction of the proinflammatory cytokines IL-1β and IL-18. For wild-type NLRP3, different pathogen and host-related signals are required to activate the NLRP3 inflammasome, which is formed by NLPR3, the adaptor protein ASC and the effector enzyme pro-caspase-1. Once the inflammasome is formed, pro-caspase-1 is activated and cleaves pro-IL-1β and pro-IL-18 to their active forms and gasdermin D which then its N-terminal fragment form pores in the plasma membrane, through where IL-1β, IL-18 and intracellular content are released. Gasdermin D pores then drives a specific type of cell death called pyroptosis. However, the activation and regulation mechanism of mutant NLRP3 is still poorly known. Questions such as how the activity of mutated NLRP3 is regulated in sterile conditions in patients; whether MCC950 (a specific inhibitor of NLRP3) is able to inhibit this activation; what molecules besides IL-1β and IL-18 are implicated downstream the activation pathway; and how NLRP3 mutant is regulated at post-translational level are still unknown. Nlrp3 -deficient immortalized mouse macrophages with a Tet-ON inducible system were used to express several NLRP3 variants with mutations present in CAPS patients and compared to macrophages transduced with empty vector or