Anales de la RANM

274 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS: PERSPECTIVA ACADÉMICA Velázquez-Campoy A An RANM. 2023;140(03): 270 - 276 disulfuro para mantener su estructura, como sí ocurre en proteasas estructuralmente similares (ej. quimotripsina), sino que el átomo de zinc es el elemento clave cohesionador de su estructura: en ausencia de zinc la proteasa NS3 se despliega considerablemente (alrededor de la mitad de la estructura se desordena) y en presencia de zinc adopta una estructura completamente plegada, e incluso razonablemente activa en ausencia de NS4A (9-11). La interacción con el cofactor zinc proporciona casi el 80% de la energía de estabiliza- ción de la estructura molecular de NS3. El hecho de que la proteasa NS3 presente un estado parcialmente desplegado en ausencia de zinc no es una mera curiosidad, sino que es un hecho con importantes consecuencias fisiológicas. Debido a la baja concentración intracelular de zinc libre (12) y a que la proteasa NS3 debe plegarse en ese ambiente desfavorable una vez sintetizada en el ribosoma, el estado parcialmente desplegado e inactivo en ausencia de zinc constituye un punto débil de esta diana y una ventana de oportunidad para actuar sobre ella con compuestos bioactivos: moléculas pequeñas que interaccionen con y estabilicen el estado alternativo no nativo, parcialmente desple- gado, inactivo que predomina en ausencia de zinc bloquearán la acción de la proteína actuando como inhibidores alostéricos. Teniendo en cuenta esta estrategia, realizamos un cribado experimental de una quimioteca de 1200 compuestos aprobados por la FDA (Prestwick Chemical Library) considerando NS3 desprovista de zinc como diana y detectando alteraciones en el perfil de desplegamiento térmico (estabilidad conformacional) de la diana inducidas por la presencia de compuestos. Mediante este procedi- miento fuimos capaces de identificar fármacos conocidos (reposicionamiento de fármacos) que interaccionan con la proteasa NS3 libre de zinc, atrapan y estabilizan la proteína inactiva y bloquean el ciclo viral (13). La eficacia de estos compuestos fue confirmada en ensayos con células empleando un sistema replicón (pseudovirus que mimetiza la replicación viral y permite cuanti- ficar con la tasa de replicación mediante actividad luciferasa). La eficacia y citotoxicidad de estos compuestos mostraron características promete- doras: bajo peso molecular, potencia moderada-alta (EC50 entre micromolar y nanomolar), y citotoxi- cidad moderada-baja. Como estos inhibidores mostraban un nuevo mecanismo de acción, podrían combinarse con los inhibidores competitivos que estaban en desarrollo para diseñar una terapia combinada antiviral altamente activa. Una ventaja adicional de estos inhibidores alostéricos es que no se verían afectados por mutaciones de resistencia usuales que afectan a inhibidores competitivos (ortostéricos), como pudimos comprobar. Como curiosidad, también realizamos un cribado experi- mental utilizando la proteasa NS3 con zinc (activa) detectando reducción en la actividad proteasa empleando un substrato peptídico FRET ( Förster resonance energy transfer ) inducida por la presencia de compuestos. pero los resultados no fueron tan destacables (potencia de inhibición moderada). Estos compuestos fueron protegidos mediante una patente internacional e incluso iniciamos algunos ensayos en ratones infectados con el virus de la hepatitis C. Desafortunadamente para nosotros, y afortunadamente para todos, para ese momento ya había varios fármacos basados en inhibidores de la proteasa NS3 con una alta eficacia y elevados niveles de seguridad que han permitido la curación de esta grave enfermedad, de modo que nuestro trabajo, aun siendo interesante desde el punto de vista académico, había perdido su relevancia terapéutica. Este proyecto nos hizo recapacitar sobre otras proteínas dependientes de zinc susceptibles de ser abordadas con esa misma estrategia experi- mental, y seleccionamos BFT-3, Bacteroides fragilis toxin 3 o fragilisina. BFT-3 es una metaloproteasa dependiente de zinc que es secretada por B. fragilis y constituye el único factor de virulencia de esta bacteria (14). B. fragilis es uno de los principales comensales en el tracto digestivo humano. Normal- mente inofensivo, en condiciones disbióticas puede causar diarrea, abscesos, inflamación crónica, y cáncer colorrectal. Por tanto, realizamos un cribado experimental con la quimioteca Prestwick conside- rando BFT-3 desprovista de zinc como diana y detectando alteraciones en el perfil de desplega- miento térmico (estabilidad conformacional) de la diana inducidas por la presencia de compuestos. De nuevo, fuimos capaces de identificar fármacos conocidos (reposicionamiento de fármacos) que interaccionan con BFT-3 libre de zinc, atrapan y estabilizan la proteína inactiva, bloqueando la actividad de la toxina (15). La eficacia de estos compuestos fue confirmada en ensayos in vitro e in cellulo, e incluso pudimos obtener la estruc- tura cristalográfica de varios complejos enzima- inhibidor, en colaboración con el grupo de F. Xavier Gomis-Rüth (IBMB, Institute of Molecular Biology of Barcelona), en los que se pudo observar la interacción de estos compuestos localizados en un exositio (alostérico) alejado del sitio activo de la toxina (pdb: 7POL, 7POO, 7POQ, 7POU). UN CASO EXITOSO DE FÁRMACOS FRENTE A UNA IDP: CÁNCER PANCREÁTICO En 2013 nuestro grupo inició una colaboración con Juan Iovanna (CRCM, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille) y José Luis Neira (UMH UniversidadMiguel Hernández, Elche) para estudiar interacciones de la proteína NuPR1 (también conocida como p8 y COM1) con otras biomolé- culas. Juan Iovanna es un experto mundialmente reconocido en cáncer pancreático y descubridor de NuPR1 como proteína de estrés celular que promueve crecimiento, proliferación, migración e invasión celular, y progresión tumoral, así como reparación de DNA entre otras muchas funciones, que aparece sobreexpresada en pancreatitis aguda y adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) (16,17). El silenciamiento o la pérdida de NUPR1 provocan la reducción de proliferación, migración,