Anales de la RANM

23 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO DE LA ANEMIA FALCIFORME Ferrer Benito S, et al. An RANM. 2024;141(01): 21 - 29 que avanza el embarazo y en respuesta a factores maternos o fetales. En las últimas dos décadas, se ha avanzado significativamente en la compren- sión del ADN libre fetal, ya que su presencia nos permite obtener información genética del feto a partir de sangre materna (11, 12). A pesar de estos avances, el DPNI se enfrenta a desafíos debido a la coexistencia del ADN materno y del fetal, así como a la baja concentra- ción de ADN libre fetal en la sangre materna, lo que ha dado lugar a falsos negativos y diagnós- ticos incorrectos en algunos casos. Sin embargo, el DPNI se ha convertido en una parte integral de la práctica clínica y se utiliza para determinar el sexo fetal (13), evaluar el factor RhD (14), realizar el cribado de aneuploidías comunes y diagnosticar mutaciones paternas o de novo (15). Para enfermedades monogénicas, la aplicación del DPNI ha estado limitada a aquellas con herencia paterna y de novo debido a la mayor complejidad de distinguir los alelos maternos de los fetales. En estos casos, las técnicas de análisis varían según la base genética subyacente, incluyendo técnicas como la PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR), PCR en tiempo real (RT-PCR) y Minisecuencia- ción o SNaPshot (16). No obstante, para enfermedades en las cuales ambos progenitores poseen la misma mutación, el DPNI no se basa en el principio de presencia/ ausencia de la mutación, inútil en este contexto ya que la madre presenta el alelo wildtype y mutado y no se puede determinar si la mutación observada es materna o fetal, sino en el estudio de la dosis relativa mutacional (RMD) (12, 16), llevado a cabo mediante PCR digital (dPCR). La dPCR permite una cuantificación absoluta de los alelos wild type y mutado de forma altamente sensible y específica (17). Esta cuantificación permite conocer si existe equilibrio o desequilibrio alélico entre los alelos normal y mutado en la muestra observada, esperando que una mujer sin transfu- siones ni embarazada se encuentre en equilibrio alélico, 50:50 entre los alelos wildtype y mutado. Esto unido a la presencia de ADN fetal en plasma materno, resulta en que pueda darse un desequili- brio dado por la contribución fetal al ADN total, de forma que si la madre y el feto comparten el mismo genotipo se mantiene el equilibrio alélico; mientras que si el feto es homocigoto habrá un aumento del alelo del que sea homocigoto el feto (18). Presentamos los resultados preliminares de un estudio piloto en proceso de validación de un método de DPNI para la detección de la ECF mediante dPCR. MATERIAL Y MÉTODOS Se llevó a cabo un estudio observacional con intervención diagnóstica que incluyó a 9 mujeres embarazadas con rasgo falciforme (βA/βS) y mujeres no embarazadas con los tres posibles genotipos: 6 homocigotas wildtype (βA/βA), 8 heterocigotas (βA/βS), y 6 homocigotas para la mutación (βS/βS). Se excluyeron aquellas mujeres que recientemente hubieran recibido transfusiones sanguíneas, trasplantes alogénicos, terapias inmunológicas o de células madre debido a posibles interferencias por ADN exógeno y gestaciones múltiples. Las muestras fueron reclutadas en varios hospitales de Madrid, Clínico San Carlos, Universitario de Getafe, Universitario Príncipe de Asturias y en los hospitales Universitario de Cruces (Bilbao), Universitario de Guadalajara, Universitario Marqués de Valdecilla (Santander), Clínico Univer- sitario Virgen de la Arrixaca (Murcia), General de Segovia y Universitario Miguel Servet (Zaragoza). Las muestras fueron procesadas y caracterizadas molecularmente en el laboratorio de Eritropato- logía del servicio de Hematología del Hospital Clínico San Carlos. Se realizó un estudio hemati- métrico convencional y un recuento de reticulo- citos utilizando un contador automático de células (UniCel DxH 800, Coulter Cellular Analysis System, Beckman Coulter). La identificación y cuantificación de la HbS y las distintas fracciones de hemoglobina se llevaron a cabo mediante HPLC de intercambio iónico (Variant II, BioRad) y electroforesis capilar (Minicap Flex Piercing, Sebia). Para el análisis molecular, se extrajo el ADN de sangre periférica mediante extracción automática de los leucocitos (EZ1, Qiagen) y se caracterizó empleando el kit comercial β-Globin StripAssay® MED (ViennLab). La obtención del ADN libre circulante se realizó recolectando sangre perifé- rica entre la semana 10 y 20 de gestación en tubos K3EDTA Cell-free DNA BCT (Streck). Posterior- mente, se extrajo el ADN libre circulante utilizando el kit comercial QIAamp Circulating Nucleic Acid kit (Qiagen). La caracterización molecular del ADN libre circulante se llevó a cabo mediante dPCR [QuantS- tudio 3D Digital PCR System (Thermo Fisher)] con sondas TaqMan específicas para el alelo mutado (FAM) y el alelo wildtype (VIC) (Tabla 1). Esto permitió una cuantificación absoluta de ambos alelos mediante el software QuantStudio 3D AnalysisSuite Cloud Software (ThermoFisher) y determinar el RMD de la mutación (HBB: c.20A>T) mediante la siguiente fórmula: RMD = [Nº eventos positivos marcados con FAM (mutado)]/(Nº de eventos positivos totales VIC +FAM). Los valores de RMD obtenidos se tradujeron en valores de z-score utilizando una fórmula (19) basada en una población de referencia de mujeres heterocigotas no embarazadas, estableciendo rangos de equilibrio/desequilibrio para asociar al feto un genotipo determinado.