Anales de la RANM

23 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 S U P L E M E N T O III SIMPOSIO · JÓVENES INVESTIGADORES Libro de Abstracts An RANM. 2024;141(02).supl01: 23 - 40 ‡       ˆ Julio García-Villalba Fernández 1 , Laura Hurtado Navarro 1 , Ana Isabel Gómez Sánchez 1 , Diego Angosto- Bazarra 1 , Pablo Pelegrín 1,2 1. Instituto Murciano de Investigación Biosanitarias Pas- cual Parrilla (IMIB-Pascual Parrilla) 2. Depto. de Bioquímica y Biología Molecular B e Inmu- nología, Universidad de Murcia Antecedentes El virus SARS-CoV-2 es el agente causal de la enfermedad conocida como COVID-19. Este patógeno infecta principalmente células del tracto respiratorio causando diferente sintomatología; los casos graves evolucionan a neumonía con hipoxia y síndrome de di cultad respira- toria aguda (SDRA) caracterizado por una in ama- ción pulmonar persistente, y un aumento del nivel de citocinas proin amatorias en el torrente sanguíneo como IL-6, IL-1β e IL-18. Este fenómeno se conoce como “tormenta de citocinas”, en la que está implicado, entre otros procesos, la activación del in amasoma NLRP3 y una muerte celular piroptótica. De este modo, NLRP3 está directamente relacionado con la gravedad del SDRA producido por la COVID-19, por ello, es de gran interés conocer cuáles son las causas o vías de activación del in amasoma NLRP3 en esta patología para así poder proporcionar nuevas estrategias terapéuticas. Métodos La línea celular HEK293T con expresión consti- tutiva de NLRP3-YFP se transfectó con construc- ciones plasmídicas que codifican diferentes proteínas de SARS-CoV-2, así como con plásmidos que expresan componentes del inflamasoma: ASC-RFP, YFP-NLRP3-Luc y caspasa-1. Se evaluó la activación de NLRP3 al observar una localización punteada de NLRP3 tras 48h de transfección mediante microscopía de fluorescencia en presencia/ausencia de MCC950 o KCl para bloquear NLRP3, o con el ionóforo de potasio nigericina como activador de NLRP3. Además, la activación del inflamasoma se evaluó mediante citometría de flujo detectando oligómeros de ASC intracelulares tras 24h de transfección en presencia/   Aitana Rickert-Llàcer 1 , Rafael González-Cano 1 , Enrique Cobos 1 , Miguel Ángel Tejada 1 1. Departamento de Farmacología, Centro de Investi- gación Biomédica e Instituto de Neurociencias, Univer- sidad Granada e Instituto de Investigación Biosanitaria ibs.GRANADA. La endometriosis es un trastorno inflama- torio crónico producido por la implantación y el crecimiento de tejido endometrial funcional en sitios extrauterinos. Se calcula que la enfermedad afecta al 10% de las mujeres en edad reproductiva, lo que representa unos 193 millones de mujeres en todo el mundo. Alrededor del 50% de las mujeres con endometriosis presentan síntomas asociados, como dolor pélvico. El dolor crónico es un síntoma también permitió corroborar que la glicina actúa inhibiendo la proteína ninjurina-1, pero no bloquea la permeabilización de la membrana mediante el fragmento N-terminal de gasdermina. En conclusión, estos resultados son importantes para entender los procesos que conllevan a la liberación de ATP durante la muerte celular piroptótica, así como para revelar nuevas estrate- gias terapéuticas en el tratamiento de enferme- dades mediante la modulación farmacológica de las gasderminas y ninjurina-1. ausencia de nigericina y se verificó su actividad mediante Western blot detectando formas activas de caspasa-1. La localización del punteado de NLRP3 tras activarse, se estudió por inmunofluorescencia empleando marcadores de distintos orgánulos intrace- lulares. En células epiteliales primarias humanas de las vías respiratorias (HSAEC) se transfectaron construc- ciones plasmídicas que codifican diferentes proteínas de SARS-CoV-2 y el inflamasoma NLRP3, se evaluó la expresión de genes relacionados con el inflamasoma, como ASC, caspasa-1 e IL-1β, y la liberación de IL-1β se detectó mediante ELISA en el sobrenadante celular en presencia/ausencia de nigericina. Resultados La expresión de ORF7b fue la única proteína de SARS-CoV-2 testada que aumentó el porcentaje de células con un punteado de NLRP3 tras 48h de transfección. MCC950 disminuyó la distribución punteada de NLRP3 tras la expresión con ORF7b. La expresión de ORF7b aumentó la activación de NLRP3 tras tratar con nigericina, aumentó el número de células con oligómeros de ASC y el procesamiento de caspasa-1. En los estudios de inmunofluores- cencia se observó que la expresión de ORF7b induce la desestructuración de la red trans-Golgi, siendo este fenómeno un paso clave en la activación de NLRP3. Por último, ORF7b aumenta la expresión de ASC, caspasa-1, e IL-1β en células HSAEC, así como induce una mayor liberación de IL-1β. Conclusiones Nuestro estudio muestra que la proteína ORF7b de SARS-CoV-2 promueve la activación del inflama- soma NLRP3 con la formación de oligómeros de ASC y la activación de caspasa-1. Además, induce un aumento en la expresión de genes relacionados con la actividad de NLRP3 en células HSAEC. La activación de NLRP3 podría estar promovida por la desorganización de la red trans-Golgi que induce la presencia de ORF7b.