Anales de la RANM

31 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 S U P L E M E N T O III SIMPOSIO · JÓVENES INVESTIGADORES Libro de Abstracts An RANM. 2024;141(02).supl01: 31 - 40  €  J. Alejandro Bueso 1 , Carmen Pérez 1 , Rocío Bravo 2,3 , David Otaegui 2,3 , Valle Palomo 1,3 1. IMDEA Nanociencia, Calle Faraday 9, 28049 Madrid, Spain. E-mail: valle.palomo@imdea.org 2. IIS Biogipuzkoa, Paseo Dr. Begiristain, s/n, 20014 San Se- bastián, Gipuzkoa Spain, 3. CIBERNED Centro de Investigación Biomédica en Red En- fermedades Neurodegenerativas, Calle de Valderrebollo 5, 28031 Madrid, Spain. La esclerosis lateral amiotrófica (ALS) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las motoneuronas superiores e inferiores, que están relacionadas con los movimientos voluntarios. Los modelos animales actuales no reflejan la patología humana y no son tan heterogéneos como la enfermedad. La proteína TDP-43 se encuentra gravemente desregulada y agregada en el 97% de pacientes esporádicos (sALS), y muestra una Figura 1. Representación esquemática del aislamiento de EVs, y su utilización en ensayos de NTA, inmunomarcaje y detección de proteínas. Además, hemos aplicado nuestro enfoque a diferentes modelos de enfermedades neurodege- nerativas utilizando toxinas conocidas por simular estas in vivo. Compuestos como el ácido okadaico y el ácido etacrínico se emplean para imitar el estado fisiopatológico de determinadas proteínas involu- cradas en la enfermedad de Alzheimer (4) y ELA (5) respectivamente. La 6 hidroxidopamina (6) imita el estado de estrés oxidativo, neurodegeneración y neuroinflamación característicos de la enfermedad de Parkinson. Hemos medido el movimiento de ambas proteínas en células pretratadas con fármacos conocidos para cada enfermedad (TDZD8, IGS2.7, S14) y lo hemos comparado con células no tratadas. propagación de tipo priónico. La proteinopatía de TDP-43 se observa en los modelos linfoblásticos. En este estudio, nuestro objetivo es caracterizar las vesículas extracelulares (EVs) producidas por el modelo linfoblástico en cuanto a concentración, fenotipo y cargo, y ver cómo afectan los tratamientos a estos parámetros. Los linfoblastos se obtienen a partir de la inmorta- lización de linfocitos B con el virus de Epstein- Barr. Los linfoblastos derivados de controles sanos y de pacientes de sALS se cultivaron en medio libre de exosomas y fueron tratados con IGS-2.7, un inhibidor de la caseína kinasa 1 (CK1), y riluzol. Las EVs obtenidas a partir de estas células fueron aisladas utilizando el kit Total Exosome Isolation Reagent (TEIR) o centrifugaciones seriadas terminadas en ultracentrifugación (UC). La concen- tración de partículas se midió realizando un Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) utilizando el Nanosight NS300. Después del aislamiento de EVs, se marcaron con Quantum Dots (QD): aproxi- madamente 1x108 EVs se incubaron con 20 ng de anticuerpo biotinilado anti-CD9/CD63/CD81 y 0.17 nM QD. Los anticuerpos y los QD se unen mediante las interacciones de biotina-estreptavi- dina. Las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81 fueron evaluadas en el ExoView. Se realizó un estudio de identificación masiva de proteínas (shotgun proteo- mics) para las EVs, en el que 5725 proteínas fueron identificadas inicialmente. Después del filtrado, 5551 proteínas fueron evaluadas. Al comparar los métodos de aislamiento, 7 proteínas diferencial- mente expresadas se comparten entre los grupos (p = 0.05). Estas proteínas son AK1A1, PR38A, CKLF3, RFA2, BMPR2, CD82, WSDU1. De las 100 proteínas más comunes en bases de datos de EVs, en nuestras muestras fueron detectadas un 90%. Existen diferencias significativas en la concentración de EVs producidas por linfoblastos de controles sanos y de pacientes de sALS. Estas diferencias se modulan con la inhibición de la CK1 y con el tratamiento de riluzol, lo cual afecta de forma distinta a cada línea