Anales de la RANM

35 A N A L E S R A N M R E V I S T A F U N D A D A E N 1 8 7 9 IMPLEMENTACIÓN DE LA NGS EN EL DIAGNÓSTICO DE HEMOGLOBINOPATÍAS Ropero P, et al. An RANM. 2026;143(01): 33 - 47 ficada previamente), hallazgos sugestivos en HPLC o electroforesis capilar, cribado neonatal alterado, estudio familiar de portadores y reevaluación de casos previamente estudiados mediante técnicas convencionales con resultado no concluyente. Dado que el centro actúa como laboratorio nacional de referencia, una proporción relevante de las muestras correspondía a casos complejos o con discordancia fenotipo–genotipo previa, lo que puede haber influido en la elevada tasa de hallazgos moleculares observada. Para cada muestra remitida se recogieron datos clínicos básicos —edad, sexo, nacionalidad y motivo de solicitud—, integrándolos posterior- mente con los resultados hematimétricos. Los parámetros evaluados (Hb, VCM, HCM y ADE) constituyen la base del algoritmo diagnóstico inicial recomendado para anemias congénitas y hemoglobinopatías [8]. Las fracciones de hemoglobina (HbA₂, HbF y variantes estructurales) fueron determinadas mediante HPLC y electroforesis capilar, técnicas reconocidas como estándar de referencia para el cribado inicial de hemoglobinopatías durante la última década [9]. La extracción del ADN genómico se realizó utilizando el sistema automatizado BioRobot EZ1 (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), siguiendo las especificaciones del fabricante. La cuantifi- cación se efectuó en un Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) con el kit Qubit™ dsDNA High Sensitivity Assay, un método fluori- métrico ampliamente validado para asegurar la pureza y concentración del ADN previo al análisis molecular [10]. El ADN obtenido se sometió a secuenciación masiva mediante el panel Devyser Thalassemia NGS (Devyser, Stockholm, Sweden), diseñado específicamente para el análisis integral de hemoglobinopatías. La aplicabilidad y eficiencia de paneles NGS dirigidos para hemoglobinopa- tías han sido demostradas en diversos estudios recientes, que destacan su alta sensibilidad para detectar SNV, indels y deleciones/duplicaciones en genes globínicos [3,4,11]. El panel incluía secuencias completas de HBA1, HBA2, HBB, HBD, HBG1 y HBG2 , abarcando regiones codificantes y no codificantes con relevancia clínica. La incorporación simultánea de genes alfa, beta, delta y gamma responde a la necesidad creciente de identificar combinaciones multigénicas y variantes moduladoras del fenotipo [12]. El análisis bioinformático se realizó mediante AmpliconSuite v3.2, una plataforma especia- lizada diseñada para el análisis de paneles de amplicones. La clasificación de variantes se llevó a cabo siguiendo las guías ACMG/AMP, estándares internacionales ampliamente adoptados en el diagnóstico molecular [5]. Debido al elevado grado de homología entre HBA1 y HBA2 , cualquier variante detectada en regiones susceptibles de asignación ambigua fue confirmada mediante secuenciación Sanger, ya que las regiones con alta similitud de secuencia son propensas a errores técnicos. Numerosos estudios han demostrado que los hallazgos deben confirmarse mediante técnicas indepen- dientes basadas en principios distintos [13]. Asimismo, las grandes deleciones del clúster alfa y beta fueron identificadas inicialmente mediante el análisis de profundidad de lectura ( read depth ) generado por el panel NGS. Posteriormente, estas alteraciones estructurales fueron confirmadas mediante MLPA, técnica considerada estándar de referencia para la validación de deleciones y duplicaciones en los clústeres globínicos [14]. Como parte de nuestras medidas de control de calidad, el laboratorio participa de forma continuada en programas internacionales de control externo específicos para hemoglobino- patías (UK NEQAS) y aplica controles internos y externos en todas las técnicas, garantizando la fiabilidad y trazabilidad de los resultados obtenidos (UK NEQAS Haemoglobinopathy scheme reports, 2018-2024. https://ukneqas.org. uk). Finalmente, el rendimiento diagnóstico del panel se evaluó integrando los hallazgos molecu- lares con los datos hematológicos y electroforé- ticos previos. Se consideró que el NGS aportaba un beneficio clínico cuando permitía resolver discordancias fenotipo–genotipo, aclarar HbA₂ límite, identificar persistencias heredi- tarias de HbF, detectar combinaciones alfa/ beta complejas o corregir diagnósticos previos basados únicamente en hematimetría o técnicas bioquímicas. Este enfoque combinó la potencia analítica del NGS con la práctica clínica real, permitiendo una caracterización precisa y comprensiva del perfil genético de las hemoglo- binopatías en una cohorte amplia y diversa [15]. RESULTADOS La cohorte estuvo constituida por 1.200 pacientes, con una edad media de 33,4 ± 22,1 años (rango: 0–100). La distribución por sexo fue equili- brada, con un 51,8 % de mujeres y un 46,6 % de varones. En términos de procedencia, la población analizada mostró una marcada hetero- geneidad geográfica. En 41 casos (3,4 %) no se disponía de información sobre el país de origen en el momento del análisis. Entre los 1.159 pacientes con procedencia conocida, 511 eran de origen español, 34 europeos y 326 procedían de distintos países de América Latina, princi- palmente Colombia (n=85) y República Domini- cana (n=83). Asimismo, se incluyeron más de 80 pacientes del norte de África, casi todos