Estudio de vesículas extracelulares en modelos derivados de pacientes de Esclerosis Lateral Amiotrófica

J. Alejandro Bueso1, Carmen Pérez1, Rocío Bravo2,3, David Otaegui2,3, Valle Palomo1,3

1. IMDEA Nanociencia, Calle Faraday 9, 28049 Madrid, Spain. E-mail: valle.palomo@imdea.org
2. IIS Biogipuzkoa, Paseo Dr. Begiristain, s/n, 20014 San Sebastián, Gipuzkoa Spain,
3. CIBERNED Centro de Investigación Biomédica en Red Enfermedades Neurodegenerativas, Calle de Valderrebollo 5, 28031 Madrid, Spain.

La esclerosis lateral amiotrófica (ALS) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las motoneuronas superiores e inferiores, que están relacionadas con los movimientos voluntarios. Los modelos animales actuales no reflejan la patología humana y no son tan heterogéneos como la enfermedad. La proteína TDP-43 se encuentra gravemente desregulada y agregada en el 97% de pacientes esporádicos (sALS), y muestra una propagación de tipo priónico. La proteinopatía de TDP-43 se observa en los modelos linfoblásticos. En este estudio, nuestro objetivo es caracterizar las vesículas extracelulares (EVs) producidas por el modelo linfoblástico en cuanto a concentración, fenotipo y cargo, y ver cómo afectan los tratamientos a estos parámetros.

Los linfoblastos se obtienen a partir de la inmortalización de linfocitos B con el virus de Epstein-Barr. Los linfoblastos derivados de controles sanos y de pacientes de sALS se cultivaron en medio libre de exosomas y fueron tratados con IGS-2.7, un inhibidor de la caseína kinasa 1 (CK1), y riluzol. Las EVs obtenidas a partir de estas células fueron aisladas utilizando el kit Total Exosome Isolation Reagent (TEIR) o centrifugaciones seriadas terminadas en ultracentrifugación (UC). La concentración de partículas se midió realizando un Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) utilizando el Nanosight NS300. Después del aislamiento de EVs, se marcaron con Quantum Dots (QD): aproximadamente 1×108 EVs se incubaron con 20 ng de anticuerpo biotinilado anti-CD9/CD63/CD81 y 0.17 nM QD. Los anticuerpos y los QD se unen mediante las interacciones de biotina-estreptavidina. Las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81 fueron evaluadas en el ExoView. Se realizó un estudio de identificación masiva de proteínas (shotgun proteomics)  para las EVs, en el que 5725 proteínas fueron identificadas inicialmente. Después del filtrado, 5551 proteínas fueron evaluadas. Al comparar los métodos de aislamiento, 7 proteínas diferencialmente expresadas se comparten entre los grupos (p = 0.05). Estas proteínas son AK1A1, PR38A, CKLF3, RFA2, BMPR2, CD82, WSDU1. De las 100 proteínas más comunes en bases de datos de EVs, en nuestras muestras fueron detectadas un 90%.

Figura 1. Representación esquemática del aislamiento de EVs, y su utilización en ensayos de NTA, inmunomarcaje y detección de proteínas.

Existen diferencias significativas en la concentración de EVs producidas por linfoblastos de controles sanos y de pacientes de sALS. Estas diferencias se modulan con la inhibición de la CK1 y con el tratamiento de riluzol, lo cual afecta de forma distinta a cada línea derivada de paciente. La metodología para aislar las EVs tiene un gran impacto en los resultados, remarcando la importancia de una caracterización exhaustiva de las EVs. El ensayo de inmunomarcaje y el estudio proteómico confirman la presencia de EVs en nuestras muestras.