Mejora de la eficacia en la modulación del reloj circadiano mediante nanopartículas dirigidas al cerebro

Las alteraciones del reloj circadiano (CC) podrían estar acelerando la progresión de la enfermedad de Alzheimer (EA). En modelos preclínicos, varios compuestos que modulan el CC han demostrado eficacia en la reducción de los síntomas de la EA, pero su éxito clínico ha sido limitado debido a la baja penetración cerebral y a la dificultad para determinar la dosis adecuada. Las nanopartículas (NPs) dirigidas al sistema nervioso central, al facilitar el transporte a través de la barrera hematoencefálica (BHE), constituyen una solución para administrar estos fármacos y permiten abordar las disfunciones del CC en la EA, ofreciendo una nueva estrategia farmacológica.

En este trabajo se han sintetizado NPs de PLGA y se han funcionalizado con dos péptidos dirigidos al cerebro derivados de angiopep-2 y transferrina con estabilidad plasmática. Las NPs se marcaron conjuntamente con dos fluoróforos para evaluar su permeabilidad en un modelo de BHE en chip (BHEoC), con dos canales en los que se co-cultivaron células endoteliales cerebrales humanas, astrocitos y pericitos. La capacidad de las NPs para atravesar la BHE in vivo se evaluó mediante inyección en la vena caudal de ratones y se cuantificó la fluorescencia de las nanopartículas en cortes cerebrales. Para la modulación del CC, se evaluó un modulador de casein kinasa 1 (CK1) en el modelo de Per2::Luc U2OS tanto como fármaco libre y encapsulado.

Las NPs obtenidas presentaron una población monodispersa, con un diámetro hidrodinámico de entre 100 y 150 nm. La funcionalización con los péptidos dirigidos al cerebro se confirmó mediante resonancia magnética nuclear, con una eficiencia de conjugación del 50%. Los estudios de internalización mostraron la colocalización de ambos fluoróforos, confirmando se la integridad de las NPs durante la endocitosis celular. El estudio en el modelo BHEoC mostró un aumento de 2,35 veces en la capacidad de cruce de la BHE de las NP funcionalizadas con el derivado de transferrina en comparación con las no-funcionalizadas. In vivo, las mismas NPs mostraron un aumento de 1,95 veces en la permeabilidad cerebral en comparación con las NPs control (Figura 1). Por último, el modulador sintético de CK1 encapsulado mostró una modulación del período del ritmo circadiano de manera dosis-dependiente. Debido a sus características fisicoquímicas, este fármaco libre no presenta una modulación del CC, lo que pone de manifiesto la ventaja de estas NP para la administración eficaz de estos fármacos (Figura 1).

Por tanto, las NPs desarrolladas atraviesan con éxito la BHE in vitro e in vivo. Se optimizó la encapsulación de moléculas moduladoras del CC, y se evaluó un nuevo compuesto sintético gracias a la mejora de sus propriedades.

Figura 1. Evaluación de la permeabilidad de las NPs a través de la BHE y su modulación del reloj circadiano. A, Células sembradas en el chip (x4) con ampliación de la barrera formada por células endoteliales (x40). Azul, Hoesch. Las barras de escala son de 100 μm. B, Imágenes de fluorescencia del BHEoC tras 30 minutos de incubación (x4). Rojo, Cy5. La barra de escala es de 250 μm. C, Pe (cm/s) de las diferentes NPs funcionalizadas a través de la barrera. Datos normalizados con respecto a las NP de control y presentados como media ± SEM con réplicas biológicas individuales (n ≥ 3). ANOVA unidireccional, corrección de Dunnett, comparado con las NP de control; IC del 95 %: *, p < 0,05. D, Imágenes de fluorescencia de la corteza motora (x100). Arriba, ratón inyectado con NP de control; Abajo, ratón inyectado con NP de PLGA-RTf al 10 %. Azul, DAPI; Verde, NaFL; Rojo, Cy5. La barra de escala es de 200 μm. E, Cuantificación de la penetración cerebral de las NP in vivo. Datos normalizados con respecto a las NP de control y presentados como media ± SEM (n ≥ 3). Prueba t de Student comparada con las NP de control, IC del 95 %: *, p < 0,05. F, Oscilaciones circadianas medidas mediante registro de luminiscencia en tiempo real al aumentar las concentraciones de TM1 en Per2::Luc U2OS. G, Efecto del TM1 libre y de las NP cargadas con TM1 sobre la ritmicidad circadiana. Datos normalizados con respecto al vehículo y presentados como media ± SEM (n ≥ 3). ANOVA bidireccional, corrección de Šídák, comparado con el fármaco libre; IC del 95 %: **, p < 0,01; ***, p < 0,001; ****, p < 0,0001.

Agradecimientos

Este proyecto ha sido financiado por la Unión Europea en el marco de las Acciones Marie Skłodowska-Curie, mediante el acuerdo de subvención n.º 101072895, y por la ayuda RYC2019−027489-I, financiada por MCIN/AEI /10.13039/501100011033 y por El FSE invierte en tu futuro.